撰文：郭晓强
氧气是绝大多数高级生物所必需物质，但是生命为习惯低氧环境而进化出一个保存的低氧信号应对机制，经过感知氧含量而发动不同应对。低氧信号机制的说明一方面深化对多种生理现象的了解和知道，另一方面也为相关疾病医治供给全新战略。
氧（oxygen，O）是地壳中含量最多的元素，根本以氧化物（含有氧的化合物）方式存在；而两个氧原子构成的氧分子（O2）则是大气根本成分之一，关于地球上大多数生物特别是高级生物而言具有必不可少的作用。但是，氧对生命而言具有双刃剑作用，一方面不可或缺，由于大部分生命每时每刻的能量代谢和其他生理进程都依靠氧的参加；另一方面氧还具有损害作用，氧化进程发作的自由基等副产物是损害健康重要因素之一。因而，氧的感知和调控就成为科学家重视的重要问题。
氧的发现和作用
虽然氧在自然界已存在上亿年，但真正被认知并开端研讨才仅二百多年前史。十八世纪七十年代，英国化学家普里斯特利（Joseph Priestley）、瑞典化学家舍勒(Carl Wilhelm Scheele)以及法国化学家拉瓦锡（Antoine Laurent Lavoisier）简直一起发现氧的存在，特别是拉瓦锡还对氧的作用进行了科学论述，提出焚烧实质是物质与氧的反响，抛弃了其时干流的“燃素说”，然后极大推进化学的快速开展。拉瓦锡还做出另一项重大贡献，在严厉试验数据根底上提出生物呼吸进程与物质焚烧在实质上相似，这一重要结论标志着生物氧化（前期也称为生物焚烧）范畴的诞生。
二十世纪，氧在生命进程中的作用和机制得到全面论述。氧的归宿便是生成氧化物，该进程又可分为两种类型。一种是养分物质（如葡萄糖、脂肪酸等）的氧化进程，该进程往往随同能量发作（包含ATP生成和热量开释），参加酶被称为氧化酶（或还原酶）。另一类为非直接供能的物质（如代谢废物、毒物等）的加氧进程，该进程主要为添加物质溶解性，然后有利于分泌，参加酶称为加氧酶，此外部分生物大分子（如DNA和蛋白质等）也存在这一进程，其意图在于影响生物分子结构和活性。总归，这些研讨明晰标明氧对生命具有至关重要的含义。
红细胞生成素和低氧诱导因子
氧的重要性意味着生命无法长时间阻隔氧气，但机体在特殊情况（如高原环境和短时期窒息等）时会面对氧供给缺少（低氧）情况，怎么习惯就成为生物体有必要处理的重大问题。
二十世纪六十年代，科学家发现低氧环境下机体内红细胞数量会急剧添加，以添加对氧的带着和运输才能，然后到达缓解机体缺氧情况。深化研讨发现这是源于低氧可添加促红细胞生成素（erythropoietin, EPO）含量，EPO不只成为第一个清晰的低氧诱导分子，而且人重组EPO还被广泛使用于贫血等疾病的医治。
EPO的发现和使用一起也提出一个根本科学问题，那便是EPO在低氧环境下的调控机制。1977年人EPO蛋白被纯化成功，1985年人EPO基因也被成功克隆，这些开展为进一步机制研讨奠定坚实根底。不久，美国约翰霍普金斯大学遗传学家西门扎（Gregg L. Semenza）开端测验处理这一问题。
西门扎布景是儿科学和医学遗传学，开端研讨方向是地中海贫血的发病原因。西门扎在研讨进程中无意间接触到EPO，然后从根本上改动了研讨方向。西门扎和搭档将人的EPO基因转入小鼠体内，制备出的转基因小鼠可生成更多红细胞。这一成果说明人的EPO基因不只可在小鼠体内表达，而且还可发挥正常的从红细胞生成功用。
在此根底上，西门扎决议进一步研讨EPO的表达调控。1992年，西门扎和学生在EPO调控区（非编码蛋白序列）判定出一段与低氧诱导相关的保存DNA序列，将这段序列连接到非低氧诱导基因后，可引起这些基因表达也受低氧调控，这一序列后被命名低氧应对元件（hypoxia response element, HRE）[1]。西门扎估测由于HRE是一段DNA序列，因而理论上还存在对应的特异因子，该因子可在细胞核内与HRE结兼并添加基因表达。为验证该假说，西门扎从低氧处理后的细胞核提取物中别离并纯化得到一种蛋白质，该蛋白质可与HRE特异结合。特别是该蛋白质只在低氧环境下安稳存在，常氧时蛋白质几近消失，鉴于这种特性而将其命名为低氧诱导因子1（hypoxia-inducible factor 1, HIF-1）[2]。对HIF-1组成剖析发现其含有两种亚基，别离命名为HIF-1α和HIF-1β，其间HIF-1β与前期发现的芳香烃受体核转位蛋白(aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator，ARNT) 相同，只要HIF-1α为新成分。在性质方面，HIF-1α蛋白含量受氧的严厉调控，只存在于低氧环境下下，而HIF-1β蛋白为组成型，其含量与氧的浓度无关。
西门扎随后发现，机体大部分安排都存在安稳的HIF-1α蛋白，但是EPO只在肾脏和肝脏中表达，这一现实标明HIF-1的作用应不局限于EPO调理。在这一思路指导下，西门扎小组判定出多种HIF-1调理的低氧诱导基因，包含血管内皮成长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、葡萄糖转运蛋白1（glucose transporter-1,GLUT1）。
HIF-1发现的含义在于说明低氧感知是一个非常重要的生物学进程，具有广泛的生物学含义，然后招引更多研讨人员参加对这个问题的研讨之中，极大推进了该范畴的快速开展。HIF的发现证明其对低氧应对基因表达具有重要影响，但是仍有许多问题需求答复，首要问题是常氧环境下蛋白安稳性下降原因。此刻一项看起来毫无相关的研讨为此供给了重要头绪。
VHL与低氧诱导因子
1904年，德国眼科医师冯 希佩尔（Eugen von Hippel）初次描绘了一种眼血管瘤；1927年，瑞典病理学家林道（Arvid Vilhelm Lindau）则独立描绘了一种小脑和脊髓血管瘤。后来发现，两位研讨人员描绘的其实是同一疾病，因而从60年代开端将这种疾病一致命名为冯 希佩尔-林道疾病（von Hippel-Lindau (VHL) disease）。VHL是一种遗传性疾病，患者发作血管瘤、血管母细胞瘤和肾癌等几率极大添加，而且这些肿瘤血管化现象特别显着，体内生成很多VEGF和EPO，这些特征预示着VHL可能与低氧有必定相关。1993年，该病致病基因VHL被成功测序，发现其发作功用失活性骤变，意味着VHL应为一种抑癌基因，这一开展为深化研讨作用机制奠定坚实根底。
美国分子生物学家凯林（William Kaelin）开端主意是成为一名临床医师，在约翰霍普金斯医院完结实习和训练后进入丹娜法伯癌症研讨院(Dana-Farber Cancer Institute)从事临床肿瘤学研讨。恰逢第一个抑癌基因RB判定成功，该基因骤变可导致视网膜母细胞瘤发作，这一开展掀起了抑癌基因的寻觅热潮，本来对根底研讨几无爱好的凯林也逐步改动观点，经过一段时间试验室体系训练后于1992年开端自己的抑癌基因研讨方案，选择对象是VHL骤变相关的肾癌。
凯林决议研讨VHL骤变构成肾癌发作的机制。1996年，凯林与搭档制备成功VHL骤变细胞系，然后将其与VHL基因正常细胞进行比较。他们意外发现，VHL骤变细胞即便在常氧情况下仍可很多表达低氧诱导基因如VEGF等，当为其转入正常VHL基因后这种现象消失。凯林进一步研讨发现VHL骤变细胞之所以在常氧环境下表达低氧诱导基因是由于本来应降解的HIF-1α却能够正常存在[3]，这一成果说明VHL基因骤变损坏了HIF-1α在常氧下的降解才能。
凯林的发现很好解说了肾癌高度血管化的现象，但是提出一个新问题，即VHL蛋白在常氧环境下降解HIF-1α的机制。
VHL与泛素化
80年代末，英国牛津大学分子生物学家拉特克利夫（Sir Peter John Ratcliffe）也开端重视EPO表达调控机制，他专业布景为肾脏生理，而科研原动力来自于肾脏器官对氧的敏感性。拉特克利夫在90年代前期也发现了EPO中存在HRE，并对其调控作用进行了开端研讨。拉特克利夫还发现肝癌细胞移植入小鼠体内成瘤后，在缺氧区呈现很多低氧诱导基因如VEGF和GLUT1等，当损坏HIF-1则使低氧诱导基因表达不在升高，而且肿瘤安排成长减缓。这些成果一方面证明晰低氧信号通路广泛的生物学作用，而且也与凯林肾癌的成果发作了密切联系。
待HIF-1α和VHL先后发现后，拉特克利夫对二者之间的爱好发作了浓厚爱好。由于细胞内蛋白质降解需求经过溶酶体途径或蛋白酶体途径，而HIF-1α的降解形式更像蛋白酶体，后续研讨也证明这一估测，故此开端考虑VHL在蛋白质泛素化进程中的作用。多项研讨标明，VHL蛋白其实是泛素连接酶（E3）复合物的要害亚基，而拉特克利夫则进一步证明VHL蛋白可与HIF-1α相互作用然后在低氧环境下促进其泛素化和降解[4]。多家试验室还在结构层面证明晰拉特克利夫的发现，确认了VHL催化的HIF-1α泛素化是构成常氧环境下HIF-1α蛋白安稳性下降的主要原因。
拉特克利夫等的发现很好解说了肾癌VHL基因骤变后HIF-1α含量添加和低氧信号通路增强的问题，但是仍面对一个亟待处理的重大问题，那便是细胞低氧感知和VHL发动HIF-1α泛素化怎么完成有机整合。
PHD与氧感知
靶蛋白进行泛素化润饰前往往先进行其他类型润饰以区别它与原蛋白差异，防止被过错降解，最常见的润饰为磷酸化，但是凯林和拉特克利夫发现按捺蛋白磷酸化进程并不影响HIF-1α常氧下降解速率，而削减铁离子或氧含量则显着添加HIF-1α安稳性，说明该润饰进程与铁和氧相关。2011年，两个小组选用相似战略，首要将泛素化途径阻断然后构成HIF-1α蛋白堆集，进一步剖析发现这些堆集HIF-1α的脯氨酸（proline）存在羟基化润饰，当阻断羟基化则损坏HIF-1α被VHL蛋白的辨认和随后的泛素化而使蛋白安稳性添加[5,6]。不久，拉特克利夫和搭档进一步从果蝇中判定出一种双加氧酶，其担任催化HIF-1α的羟基化[7]。哺乳动物也存在双加氧酶，称为脯氨酰羟化酶结构域蛋白（prolyl hydroxylase domain, PHD），共包含3个成员，别离为PHD1、PHD2和PHD3。PHD酶活性受O2、Fe2+、维生素C和α-酮戊二酸等的影响，这一发现的含义在于为调控PHD酶活性供给重要思路。至此，低氧信号通路根本组分被判定结束。
三位科学家和低氧信号
杂乱的低氧信号通路
三位科学家的研讨奠定了低氧信号通路根本结构，后续很多研讨进一步拓宽了这一进程的具体分子途径。
首要，低氧信号通路存在更多中介分子。现在，在人类中共发现三种HIF-α，别离为HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α，两种HIF-β，别离为HIF-1β和HIF-2β，选用不同组合可构成多种异源二聚体，然后使低氧应对机制愈加丰厚多样化。除PHD受氧调理外，还判定出另一种羟基化酶FIH（factor inhibiting HIF,FIH），其催化的HIF-α羟基化并不影响HIF-α蛋白安稳性，而是阻止其与转录共激活蛋白结合，然后构成转录激活效应下降。因而，常氧情况下HIF-α的两种羟基化润饰可完成蛋白含量和转录活性两层按捺，然后确保低氧诱导基因只能严厉在低氧环境下表达[8]。此外，HIF复合物调理靶基因表达时还常需求其他元件（作为转录共激活蛋白发挥活性）参加，闻名的如组蛋白乙酰搬运酶p300，咱们最近研讨标明多种组蛋白去甲基化酶如JMJD1A和JMJD3等也参加了低氧信号通路，然后愈加深化对低氧习惯机制的了解。
其次，低氧信号通路与其他信号通路存在杂乱的互作，最闻名的是mTOR信号通路。mTOR（mechanistic target of rapamycin）是一种蛋白激酶，可将环境钳制信号如养分缺少等于细胞内蛋白组成、脂类组成等完成有机整合。低氧信号通路和mTOR信号通路经过和谐作用而完成细胞则恶劣生存环境下的习惯。
研讨含义
低氧信号通路的发现创始了一个全新研讨范畴，具有重要的理论价值和巨大的使用潜力。低氧信号通路说明晰机体在晦气环境下的习惯机制，包含低氧促进红细胞生成增多、耗氧量下降等代偿性效应以削减氧缺少构成的机体损害。低氧信号通路对一些安排氧化损害和炎症具有维护作用，如冠状动脉疾病、外周动脉疾病、创伤愈合、器官移植排挤和结肠炎等。但是过度低氧信号也可导致机体损害，包含遗传性红细胞增多症、缓慢缺血性心肌病和阻塞性睡觉呼吸暂停等[9]。特别是大多数固体肿瘤都存在低氧信号通路反常活化现象，而且与患者预后呈负相关。低氧信号通路经过添加养分物质如葡萄糖吸取、血管生成等战略终究促进了癌细胞的增殖和搬运。
低氧信号通路的要害元件还成为疾病医治重要靶点，然后为多种疾病医治供给新战略。PHD按捺剂可有用安稳HIF-α蛋白安稳性，然后添加低氧靶基因表达，这一战略可使用于医治贫血、缺氧引起的安排损害等。按捺低氧信号通路则在癌症医治方面显示出巨大价值。以肾癌为例，肾癌是低氧效应最显着肿瘤，由于VHL骤变在肾癌中发作份额最高（达70%左右，其他肿瘤份额较低乃至缺少），最早开发的VEGF按捺剂——贝伐单抗作用机制在于按捺血管构成以减下降癌细胞养分供给，而最近开发的特异性HIF-2α拮抗剂PT2399则在细胞、动物和临床前试验中显示出较好的医治作用[10]。
总归，低氧信号通路的说明极大拓宽了生命科学和医学的研讨范畴，其重要性也越来越多得到科学界的认可，三位科学家西门扎、凯林和拉特克利夫因而于2016年共享美国有“小诺贝尔奖”之称的拉斯克根底医学奖（Albert Lasker Award for Basic Medical Research），此外还共享2010年加拿大的盖尔德纳世界奖（Gairdner International Award）等，跟着研讨深化和临床广泛使用，三位科学家也有望将来共享诺贝尔生理学或医学奖。
[本项目由河北自然科学基金(No H2014205082)赞助]
（E-mail：xiaoqiangguo123@163.com。）
[1] Semenza GL, Nejfelt MK, Chi SM, et al. Hypoxia-inducible nuclear factors bind to an enhancer located 3' to the human erythropoietin gene. Proc Natl Acad SciUSA, 1991, 88(13):5680.
[2] Wang GL, Semenza GL. Purification and characterization of hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem, 1995, 270(3): 1230.
[3] Iliopoulos O, Levy AP, Jiang C, et al. Negative regulation of hypoxia-inducible genes by the von Hippel-Lindau protein. Proc Natl Acad SciUSA, 1996, 93(20):10595.
[4] Maxwell PH, Wiesener MS, Chang GW, et al. The tumour suppressor protein VHL targets hypoxia-inducible factors for oxygen-dependent proteolysis. Nature, 1999, 399(6733):271.
[5] Ivan M, Kondo K, Yang H, et al. HIFalpha targeted for VHL-mediated destruction by proline hydroxylation: implications for O2sensing.Science, 2001,292(5516):464.
[6] Jaakkola P, Mole DR, Tian YM, et al. Targeting of HIF-alpha to the von Hippel-Lindau ubiquitylation complex by O2-regulated prolyl hydroxylation. Science, 2001, 292(5516):468.
[7] Epstein AC, Gleadle JM, McNeill LA, et al. C. elegans EGL-9 and mammalian homologs define a family of dioxygenases that regulate HIF by prolyl hydroxylation. Cell, 2001, 107(1):43.
[8] Hurst JH. William Kaelin, Peter Ratcliffe, and Gregg Semenza receive the 2016 Albert Lasker Basic Medical Research Award. J Clin Invest, 2016, 126(10):3628.
[9] Ratcliffe PJ. Oxygen sensing and hypoxia signalling pathways in animals: the implications of physiology for cancer. J Physiol, 2013,591(8):2027.
[10] Ricketts CJ, Crooks DR, Linehan WM. Targeting HIF2α in Clear-Cell Renal Cell Carcinoma. Cancer Cell, 2016, 30(4):515.
要害词氧低氧诱导因子VHL蛋白加氧酶癌症
Oxygen perception and hypoxia signal
